天麻素對血管性癡呆大鼠學習記憶能力和海馬p53表達的影響

摘要】  目的： 探討天麻素對血管性癡呆(VD)大鼠學習記憶能力和海馬p53表達的影響。方法: 將大鼠隨機分成模型組、對照組、治療組(高劑量天麻素組和低劑量天麻素組)，采用改良Pulsinelli四血管閉塞法(4VO)建立VD大鼠模型，天麻素高劑量組模型大鼠用天麻素80 mg·kg-1·d-1灌胃，天麻素低劑量組模型大鼠用天麻素40 mg·kg-1·d-1灌胃，連續4周。水迷宮檢測各組大鼠學習記憶能力，免疫組織化學檢測大鼠海馬p53免疫反應陽性細胞表達。結果: 與VD模型組比較，天麻素治療后VD大鼠學習記憶能力明顯提高，海馬p53免疫陽性神經元明顯減少(P < 0.01)，以高劑量天麻素組效果更顯著。結論: 天麻素可改善VD大鼠學習記憶能力，其機制可能與下調p53表達、抑制缺血海馬神經細胞的凋亡有關。

【關鍵詞】  癡呆，血管性; 海馬; 蛋白質p53; 迷宮學習; 記憶; 天麻素

The Effect of Gastrodine on Learning Capability, Memory and p53　Expression in Hippocampus of Vascular Dementia Model Rats

　　GAO Dongli, PAN Ya, LI Yongjiang, CHEN Can, ZHANG Min

　　(Department of Physiology, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou, China)

　　[Abstract] Objective: To study the effect of gastrodine on learning capability, memory and expression of p53 in hippocampus of vascular dementia (VD) model rats. Methods： The experimental rats were randomly divided into four groups: VD model group (group V), control group (group C), and high dose (group H) and low dose (group L) of gastrodine treatment groups. VD models were established with improved Pulsinelli four vessel occlusion (4VO)method. Gastrodine was administered intragastrically with doses of 80 mg·kg-1·d-1 and 40 mg·kg-1·d-1 to rats in groups H and L respectively daily for 4 weeks.Learning and memory abilities of rats in 4 groups were evaluated with Morris Water Maze test，and the expressions of p53 proteinum in hippocampus dentate gyrus (HDG) were examined by immunohistochemistry method. Results： The learning and memorizing abilities were significantly improved in groups H and L compared with those of group C. Expression of p53 was lower in both treatment groups, than that of group C (P<0.01), and treatment of high dose gastrodine was even more effective. Conclusions: Gastrodine can improve the learning and memorizing abilities of VD model rats. The downregulation of p53 and inhibition of ischemia hippocampus nerve cell apoptosis might be potential mechanism for the improving effects of gastrodine.

　　[Key words] dementia,vascular; hippcampus; protein p53; maze learning; memory; gastrodine

　　血管性癡呆(Vascular Dementia，VD)是指由腦缺血缺氧所引起的獲得性智能損害綜合征，是老年期癡呆的主要類型之一。腦缺血后神經細胞死亡除有壞死外，還存在凋亡形式，因此抑制缺血后神經細胞凋亡對保護神經元具有重要意義。p53是促凋亡基因之一 ，在DNA損傷、癌基因的激活等能發揮重要作用[1]。天麻素(Gastrodin，Gas)是從天麻中提煉出的主要有效成分，藥理實驗證明有較強的生物活性[2]。2008年7月～2009年4月用天麻素灌胃處理VD大鼠，觀察大鼠學習記憶能力及大鼠海馬p53表達水平，探討天麻素對VD的影響及其分子機制。

　　1 材料與方法

　　1.1 動物與試劑

　　健康、雄性SD大鼠80只，4～5月齡，體重300～330 g，由貴陽醫學院實驗動物中心提供[合格證號：SCXY(黔)2002-0001]。p53檢測試劑盒由北京中衫金橋生物技術有限公司提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 動物分組和造模 大鼠隨機分成4組，對照組、模型組、天麻素高劑量組、天麻素低劑量組，每組20只。采用改良Pulsinelli四血管阻斷法建立VD動物模型[3]。模型組、天麻素高劑量組及天麻素低劑量組燒灼雙側翼小孔內的椎動脈，造成永久性閉塞，24 h后夾閉雙側頸總動脈，5 min /次，共3次，每次間隔1 h。對照組除不燒灼椎動脈和夾閉頸總動脈外，其余步驟同前。模型制作完成后，高劑量組按80 mg·kg-1·d-1 (2 ml)給予天麻素灌胃，低劑量組按40 mg·kg-1·d-1 (2 ml)給予天麻素灌胃;對照組及模型組給予等量生理鹽水。每天1次，共4周。

　　1.2.2 學習記憶能力測試 各組大鼠于造模后第4周開始進行Morris水迷宮實驗。第1～6天行定向航行試驗，每日將大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限的順序從各入水點(各象限水池壁中點)靠池壁放入水中，記錄60 s內大鼠從水中爬上站臺所需時間為逃避潛伏期;第7天行空間探索試驗，將大鼠從第Ⅰ象限入水點放入水池，記錄2 min內大鼠在第Ⅲ象限游泳時間和穿越站臺次數。

　　1.2.3 p53的表達 水迷宮測試后，大鼠麻醉，經左心室插管，分別用生理鹽水、10%中性甲醛灌注固定，注畢斷頭取腦，置于10%中性甲醛液中浸泡固定。取海馬齒狀回記錄點前后約3 mm厚標本，經梯度脫水、透明及石蠟包埋后，行冠狀位切片，片厚4～5 μm。免疫組織化學PV二步法檢測大鼠海馬p53，嚴格按試劑說明書操作。切片脫水、透明、中性樹膠封片后，采用Leica攝像顯微鏡采圖，ImagePro Plus 6.0專業圖像分析系統分析，每張切片隨機取5個視野，每個視野采集一幅圖像，進行平均光密度(AOD)測量，取平均值作為最后結果。

　　1.2.4 統計學處理 應用SPSS 11.5統計分析軟件，數據以x±s表示。先進行單因素方差分析，組間差異采用SNK檢驗進行分析。

　　貴陽醫學院學報 34卷 4期高冬麗等 天麻素對血管性癡呆大鼠學習記憶能力和海馬p53表達的影響

         2 結果

　　2.1 學習記憶能力

　　定向航行實驗中的平均逃避潛伏期反映大鼠的學習能力，結果見表1。模型組大鼠平均逃避潛伏期與對照組比較明顯延長(P<0.05或P<0.01)天麻素組與模型組相比，平均逃避潛伏期縮短(P<0.01)。高劑量組與低劑量組比，從第2天開始平均逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)?？臻g探索實驗反映大鼠的記憶能力，結果見表2。模型組與對照組比較，第Ⅲ象限活動時間縮短、穿越站臺次數減少(P<0.01)。天麻素組與模型組比較，第Ⅲ象限活動時間延長、穿越站臺次數增多(P<0.01，P<0.05)。高劑量組與低劑量組比較，第Ⅲ象限活動時間顯著延長，穿越站臺次數增多(P<0.01，P<0.05)。表1 各組大鼠定向航行實驗平均逃避潛伏期(　表2 各組大鼠空間探索實驗第Ⅲ象限活動時間和穿站臺次

　　2.2 p53陽性神經元

　　各組大鼠海馬齒狀回顆粒細胞層p53陽性神經元表達結果見圖1和圖2。p53免疫反應陽性產物為神經元胞核內棕黃色沉淀物，少量分布在胞漿內。對照組神經元胞核p53免疫反應陽性產物明顯減少，染色極淺(圖2A)，模型組大鼠海馬齒狀回顆粒細胞層有較為密集的p53免疫陽性神經元分布，染色深(圖2B)。天麻素組神經元細胞核p53免疫反應陽性產物明顯減少，染色較淺，與低劑量組比較，高劑量組神經元細胞核內p53免疫陽性反應顆粒表達水平少，染色淺，兩者AOD值差異明顯(P<0.05)。見圖2C、2D。

　　3 討論

　　天麻為蘭科多年寄生草本植物天麻(Gastrodia elata Blume)的干燥塊莖，對眼黑頭眩、四肢拘攣、小兒風癇、蠱毒惡氣等具有良好功效。天麻素(gastrodin)為天麻的主要成分，又稱天麻苷，化學名為對羥甲基苯β D 吡喃葡萄糖苷，含量為0.33%～0.67%，藥理實驗證明天麻素有較強的生物活性，常作為衡量天麻藥材和制劑質量的指標成分。近年來，對天麻素的藥理作用及機制研究也越來越受到關注，一般認為，天麻素對神經元保護作用及延緩細胞衰老的作用可能與其具有清除自由基、改善腦循環、抑制興奮性氨基酸誘導的細胞死亡和凋亡的能力有關[4,5]。本實驗發現，模型組大鼠找到站臺的時間比對照組大鼠明顯延長;第7天撤去站臺后，模型組大鼠第Ⅲ象限游泳時間和穿越站臺次數比對照組明顯減少，尋找站臺的軌跡以穿梭游泳和環池游泳為主。結果表明，模型組大鼠學習記憶能力較對照組明顯減退，運用4VO改良法成功復制了VD模型大鼠。用天麻素治療后，大鼠找到站臺的時間較模型組明顯減少，以穿梭游泳和繞站臺游泳為主，學習記憶成績和游泳軌跡接近對照組，提示天麻素能有效改善VD大鼠的學習記憶能力，尤其是高劑量組大鼠的選擇正確率顯著提高，治療效果更佳。

　　近年來的研究顯示，隨著缺血性損傷嚴重性和持續時間等的不同可導致不同程度的神經元壞死和凋亡[6，7]。目前公認p53是最常見的促凋亡基因之一 ，p53及其相關基因在腦缺血中的表達調控已成為目前缺血神經元死亡機制中的一個關鍵性環節。VD的重要病因是大腦缺血缺氧，海馬是缺血性腦損傷中最敏感的腦區，VD發病時海馬存在明顯的細胞凋亡，其發生的病理基礎是彌漫性或局灶性腦缺血引起海馬結構或與海馬記憶相關的聯系通路的神經細胞凋亡，且凋亡細胞越多癡呆越嚴重。有實驗研究，腦缺血促進p53的表達，在介導缺血性神經元損傷中起重要作用[8]。因此認為，檢測大鼠海馬組織中p53蛋白的表達情況，可作為反映腦缺血大鼠腦組織神經元凋亡的間接指標。本實驗結果顯示，模型組大鼠海馬齒狀回顆粒細胞層有較為密集的p53免疫陽性神經元分布，神經元胞核內有豐富p53免疫陽性反應沉淀物，染色深。治療組神經元胞核p53免疫陽性神經元明顯減少，p53免疫陽性沉淀物染色較淺，以高劑量天麻素效果更顯著。實驗結果提示應用天麻素有拮抗細胞凋亡的作用，可抑制腦神經細胞凋亡的發生，顯著下調p53促凋亡基因，對癡呆模型大鼠腦內與學習記憶密切相關的海馬區的神經元起到了保護作用。認為其下調p53促凋亡基因的可能機制與降低興奮性氨基酸的神經毒性、拮抗神經元細胞凋亡、對缺血再灌注損傷的保護作用、抑制神經細胞損傷、增強免疫及抑制氧自由基系統代謝紊亂有關[9～11]。也有資料表明p53 基因參與促凋亡蛋白Bax的表達[7]。研究已證實p53是bax基因的直接轉錄因子,其水平升高可以引起隨后bax基因表達增加，導致膜通透性增加，細胞色素C由線粒體釋放入胞漿，激活天冬氨半胱氨酸酶(caspase)系統，誘導凋亡[12]。因而，p53在缺血誘導凋亡的過程中發揮重要的調控作用。

　　所以，拮抗缺血性腦病所致癡呆病人神經元細胞的凋亡，增強海馬神經元抗缺氧及抗自由基損傷的能力，改善腦缺血狀態,可能是天麻素改善癡呆癥狀的作用機理之一。本實驗結果顯示高劑量天麻素組的各項指標均優于低劑量天麻素組，提示高劑量天麻素比低劑量天麻素作用效果更強，在改善學習記憶能力、對抗VD癥狀更顯著。但天麻素是通過何種途徑降低VD大鼠海馬p53的表達，尚值得進一步研究。